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 研究方向

        细胞的有丝分裂是生长发育的重要基础。该过程容易出错,一个很小的错误就可能导致细胞染色体数目的异常,即非整倍体。非整倍体是大多数肿瘤细胞的重要特征,还可能促进癌变。同时,有丝分裂的错误也会造成DNA损伤和染色体结构异常,导致基因组的不稳定。而且,肿瘤的形成往往也是细胞分裂失控的结果,这使得有丝分裂本身成为抗癌的重要靶标。因此,对有丝分裂的研究,不仅有利于探明这一基本生命活动的规律,而且对于癌症等疾病的防治具有重要意义。

    本课题组致力于细胞周期的研究,特别是调控有丝分裂的分子机制,重点是相关蛋白激酶的功能及调节机制、组蛋白修饰对染色体时空动态的调节、着丝粒的结构与功能、姐妹染色体粘连及黏连蛋白复合体(cohesin)的功能与调节、有丝分裂的表观遗传调控、有丝分裂靶向的抗癌药物,以及有丝分裂缺陷导致的染色体不稳定性与癌症的关系。

    我们将瞄准细胞周期及有丝分裂研究的最前沿,与国内外同行紧密合作,通过对蛋白激酶生物学、染色体与着丝粒生物学,以及组蛋白密码等方向的深入研究,揭示有丝分裂的基本规律,为针对细胞分裂及其调控因子的抗癌药物研发和疾病诊断提供新的思路、靶标和技术。

 

研究进展

[2013/04]

2013年4月,浙江大学生命科学研究院汪方炜实验室在《Cell》出版社旗下的国际著名学术刊物《Trends in Cell Biology》发表题为“Histone modifications and mitosis: countermarks, landmarks and bookmarks”的综述文章,总结和展望了组蛋白修饰在有丝分裂中的重要作用。汪方炜教授是该文的第一作者和共同通讯作者。

[2014/03]

2014年3月,浙江大学生命科学研究院汪方炜实验室在欧洲分子生物学组织(EMBO)旗下的国际著名学术刊物《EMBO Reports》发表题为“Polo-like kinase-1 triggers histone phosphorylation by Haspin in mitosis”的研究论文,揭示蛋白激酶Cdk1和Plk1协同作用激活Haspin的分子机制。汪方炜实验室2012级硕士生周琳莉和田小影同学是该文的共同第一作者,汪方炜教授是共同通讯作者。此项研究由国家青年千人计划、国家优秀青年科学基金、国家自然科学基金面上项目和浙江省杰出青年基金资助。

[2017/03]

2017年3月,汪方炜实验室在《Cell》出版社旗下的国际权威学术期刊《Current Biology》发表题为“The N-Terminal Non-Kinase-Domain-Mediated Binding of Haspin to Pds5B Protects Centromeric Cohesion in Mitosis”的长文(Article)揭示姐妹染色体粘连调控的新机制。博士生周琳莉和梁材是该文的共同第一作者,汪方炜教授是通讯作者。

黏连蛋白复合体(cohesin)维持姐妹染色单体配对,并促进染色体与纺锤体的正确连接。在有丝分裂的初期,染色体臂上的cohesin复合体在其调节亚基Wapl的作用下被大量地去除,而着丝粒区的cohesin必须得以保留才能防止染色体的错误分离。以往的研究显示,癌细胞的染色体不稳定性相当多数是由于着丝粒区姐妹染色体粘连缺陷造成的。汪方炜实验室研究发现,蛋白激酶Haspin通过位于氨基端非激酶域的一个保守基序与cohesin的亚基Pds5B直接结合;而且,Haspin与Pds5B的结合能竞争性地阻碍Wapl以类似的方式与Pds5B相结合。特异性地破坏Haspin与Pds5B的结合,会造成着姐妹染色体粘连的缺陷,使得染色体不能正常整列并提前分离;而抑制Wapl的活性或恢复着丝粒区Haspin与Pds5B的结合,则可以防止姐妹染色体粘连缺陷的发生。这些结果表明,Haspin通过结合Pds5B拮抗了Wapl对着丝粒区cohesin的去除,保证了姐妹染色单体的正常粘连和正确分离,从而保护了染色体的稳定性。此项研究不仅揭示了Haspin作为cohesin复合体调节亚基的新功能,而且解析了姐妹染色体粘连调控的新机制。这项研究成果有助于深入理解染色体粘连缺陷与染色体不稳定性之间的关系。此项研究由国家青年千人计划、国家优秀青年科学基金、国家自然科学基金面上项目、英国皇家学会牛顿高级学者基金和浙江省杰出青年基金资助。

[2018/01]

2018年1月,汪方炜实验室在欧洲分子生物学组织(EMBO)旗下的国际著名学术刊物《EMBO Reports》发表了题为“A kinase-dependent role for Haspin in antagonizing Wapl and protecting mitotic centromere cohesion”研究论文阐述姐妹染色体粘连调控的重要机制。汪方炜实验室2015级研究生梁材和陈亲富为该文的共同第一作者,汪方炜教授是通讯作者。

正常人体细胞含有的46条染色体经过DNA复制变成46对姐妹染色单体,并在随后的有丝分裂期被均等地分配至两个子细胞,从而实现亲代与子代之间遗传物质的稳定传递。此过程受到细胞的严密调控,极细微的错误也可能导致子细胞染色体数目的异常,以及染色体的不稳定性和细胞的癌变。姐妹染色单体配对的建立和维系依赖于黏连蛋白复合体(cohesin)形成的环状结构。在细胞进入有丝分裂的早期,染色体臂上的cohesin在其调节亚基Wapl的作用下被大量去除,而着丝粒部位的cohesin必须予以保留,以确保所有的染色体均能与纺锤体正确连接并整齐地排列在中期赤道板上。汪方炜实验室的博士生梁材和陈亲富等发现,Haspin的激酶域对于姐妹染色体粘连具有重要保护作用。进一步的机理研究显示,一方面,Haspin的激酶域以较强的亲和力结合Wapl的重要基序PIM,从而竞争性地阻碍Pds5B结合Wapl的PIM;另一方面,Haspin磷酸化Wapl的PIM并直接削弱Wapl结合Pds5B的能力。通过这一双重机制,Haspin活性激酶域有效地抑制了Wapl与Pds5B的结合,拮抗了Wapl对着丝粒区cohesin的去除作用,确保了姐妹染色体的正常粘连和分离,从而实现对染色体稳定性的保护。

这些研究结果鉴定了Haspin的新底物Wapl,以及Wapl磷酸化修饰调控黏连蛋白复合体环状结构的新通路,阐明了Haspin如何“以少胜多”有效抑制着丝粒区Wapl活性进而保护姐妹染色体粘连的分子机制。此项研究成果有助于深入理解癌细胞染色体不稳定性的发生原因,并启发基于肿瘤细胞染色体粘连缺陷的抗癌研究。此项研究由国家重点研发计划、国家青年千人计划、国家优秀青年科学基金、国家自然科学基金面上项目和英国皇家学会牛顿高级学者基金资助。

[2018/04]

2018年4月,汪方炜实验室在欧洲分子生物学组织(EMBO)旗下的国际著名学术刊物《EMBO Reports》发表题为“HP1 links centromeric heterochromatin to centromere cohesion in mammals”的研究论文,揭示了异染色质蛋白HP1参与保护姐妹染色体粘连和染色体稳定性的分子机制。汪方炜实验室的博士生易琦和陈亲富为该文的共同第一作者,汪方炜教授是通讯作者。

染色体不稳定性是癌细胞的重要特征,并与肿瘤的发生和转移密切相关。有丝分裂期染色体异常分离既是染色体不稳定性的表现形式,也是导致染色体不稳定性的重要原因。染色体的精确分离依赖于其动粒(kinetochore)与纺锤体微管的正确连接,并在纺锤丝的牵引下完成姐妹染色体的分离并向细胞两极移动,从而实现遗传物质从亲代到子代细胞的稳定传递。动粒与微管正确连接的前提则是黏连蛋白复合体cohesin维系着丝粒(centromere)区姐妹染色体的正常粘连。着丝粒区染色体粘连的缺陷是癌细胞中染色体不稳定性的常见原因之一。绝大多数真核生物的着丝粒由高度重复的DNA序列组成,并与数十种蛋白质相结合形成复杂的结构。着丝粒区染色体呈高度凝缩的异染色质化,并表现为组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)甲基化和异染色质蛋白HP1的富集。与cohesin在染色体上的定位类似,动物细胞在进入有丝分裂时,大部分HP1从染色体臂上脱离,而着丝粒区的HP1得以保留。着丝粒区HP1对于姐妹染色体粘连的重要性及作用机制是亟需解决的重要问题。

哺乳动物的HP1包含HP1-alpha、HP1-beta和HP1-gamma三种亚型。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,汪方炜实验室在体外培养的人体细胞中实现了对HP1三种亚型的单独或两两组合敲除,进而发现HP1-alpha和HP1-gamma对于着丝粒区染色体的粘连发挥着相互冗余的保护作用。通过在HP1-alpha和HP1-gamma双敲除细胞中回补野生型或突变体HP1-alpha,易琦和陈亲富等证实HP1羧基端的结构域Chromoshadow domain(CSD),而不是氨基端结构域Chromodomain与甲基化H3K9的结合,对于HP1保护染色体粘连是重要的。进一步的机理研究发现,HP1的CSD与蛋白激酶Haspin氨基端的PxVxL基序相结合,促进Haspin在着丝粒区的定位,从而抑制cohesin负调节蛋白Wapl介导的粘连去除。这些实验结果揭示了着丝粒区异染色质对于姐妹染色体粘连的重要性,并阐明了异染色质蛋白HP1通过Haspin保护cohesin的分子机制。此项研究由国家重点研发计划、国家青年千人计划、国家优秀青年科学基金、国家自然科学基金面上项目和英国皇家学会牛顿高级学者基金资助。

[2018/07]

2018年7月,汪方炜实验室在《Cell》出版社期下的国际著名学术刊物《Cell Reports》发表题为“WAC Promotes Polo-like Kinase 1 Activation for Timely Mitotic Entry”的研究论文,揭示细胞周期的重要调控机制。汪方炜实验室的博士生戚菲菲是该文的第一作者,汪方炜教授为通讯作者。

细胞周期中各个时相的有序更迭和整个细胞周期的运行,需要“引擎”分子的驱动,即是在周期蛋白(Cyclin)依赖的蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase, Cdk)统一调控下进行的。不同的Cyclin在细胞周期中表达的时期不同,并与不同的Cdk结合,形成不同种类的Cyclin-Cdk激酶复合物,调节不同的Cdk活性,从而驱动细胞周期的有序运行。细胞从分裂间期的G2期进入到分裂期(即G2/M期转换)依赖于Cyclin B1-Cdk1激酶复合物的活性。在G2的早期,与Cyclin B1结合的Cdk1被Wee1及Myt1激酶磷酸化,导致活性的抑制。只有当蛋白磷酸酶Cdc25去除Wee1及Myt1对Cdk1的磷酸化后,Cyclin B1-Cdk1才能被激活,进而促成G2/M期转换。Cdc25的活性则依赖于蛋白激酶Plk1对其的磷酸化。因此,G2期Plk1的及时激活对于Cyclin B1-Cdk1活性的激发以及G2/M期的转换极其重要。然而,相关的分子机制目前并不清楚。

我们的研究发现,在细胞周期的G2期,通过结合Aurora-A及Plk1,WAC蛋白促成Aurora-A对Plk1的磷酸化,进而激发细胞核内Plk1的活性,从而确保G2/M期的顺利转换和细胞的正常增殖。这项研究不仅鉴定了一个新的Plk1结合蛋白WAC,揭示了其在激活Plk1中的重要作用,而且阐明了调控G2/M期转换的关键机制,对于深入理解细胞周期调控的分子机理,以及Cdk1和Plk1靶向的抗癌药物研发具有重要意义。此项研究由国家重点研发计划、国家青年千人计划、国家优秀青年科学基金、国家自然科学基金面上项目和英国皇家学会牛顿高级学者基金资助。

[2018/09]

2018年9月,汪方炜实验室在Scientific Reports杂志发表了关于染色质凝缩和基因沉默调控机制的研究论文:“HP1 cooperates with CAF-1 to compact heterochromatic transgene repeats in mammalian cells”。这项研究发现,在哺乳动物细胞中异染色质蛋白HP1与染色质组装因子(CAF-1)的结合促进多拷贝外源DNA插入区染色质的高度凝缩(即异染色质化)以及该区域基因的沉默,展示了CAF-1 在维持异染色质凝缩结构中的作用。2016级硕士生向兴峰同学为论文的共同第一作者,汪方炜教授是通讯作者。值得一提的是,法国居里研究所Dostatni实验室在模式生物果蝇中开展了相关研究,并于2017年在Genetics杂志上发表题为“Maintenance of Heterochromatin by the Large Subunit of the CAF-1 Replication-Coupled Histone Chaperone Requires Its Interaction with HP1a Through a Conserved Motif”的论文。这些研究结果显示了CAF-1维持异染色质凝缩的功能在进化上的保守性。

[2018/11]

2018年11月29日,汪方炜实验室在Journal of Biological Chemistry杂志在线发表题为“A positive feedback mechanism ensures proper assembly of the functional inner centromere during mitosis in human cells”的研究论文,揭示了有丝分裂期着丝粒组装的正反馈调控机制。博士生梁材和张振蕾是论文的共同第一作者,陈亲富等其他同学也有重要贡献,汪方炜教授为通讯作者。

染色体的正确分离依赖于姐妹染色体粘连以及动粒与纺锤体微管连接的动态调控。作为染色体上高度特化的重要功能区,着丝粒不仅是动粒组装的基础,也是有丝分裂期姐妹染色体粘连的主要部位。通过招募数十种蛋白,着丝粒的内层在调节姐妹染色体粘连和动粒-微管的连接中发挥重要作用。内层着丝粒结构和功能的缺陷会造成染色体错误分离,进而导致染色体的不稳定性。而染色体不稳定性不仅是癌细胞的常见特征,还能促进肿瘤的发生和发展。但是,调控内层着丝粒组装的具体分子机制尚不清楚。

Shugoshin(日语中意为“守护神”)是染色体稳定性的重要保护者。在体细胞中利用RNA干扰技术敲减Shugoshin家族Shugoshin-1(简称Sgo1)蛋白的表达会导致姐妹染色体粘连的丧失和着丝粒结构的严重破坏,这给Sgo1调控着丝粒组装的机理研究造成了很大的困难。博士生梁材利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,结合单链寡脱氧核糖核苷酸(single-stranded DNA oligonucleotides/ssODN)作为DNA损伤后同源定向修复的供体模板,在一株染色体相对比较稳定的人宫颈癌HeLa细胞中实现了对Sgo1基因的精准突变,即将Sgo1蛋白第492位赖氨酸残基突变为丙氨酸(简称K492A)。带有K492A突变的Sgo1失去对第120位苏氨酸磷酸化的组蛋白H2A(H2ApT120)的结合能力,并且不能像野生型Sgo1那样定位于染色体的着丝粒区。博士生张振蕾利用活细胞显微成像技术实时追踪并比较了野生型和Sgo1-K492A突变体细胞在有丝分裂期的命运,发现突变体细胞中染色体错误分离的比例明显增加(即染色体不稳定性)。而且,突变体细胞的增殖偏慢,并表现出对低浓度化疗药物紫杉醇(paclitaxel)的敏感性。

利用荧光显微技术对有丝分裂期染色体的观察发现,Sgo1-K492A突变体细胞的内层着丝粒有明显的缺陷,主要表现为该区域姐妹染色体粘连变弱和染色体乘客复合体(chromosomal passenger complex/CPC;动粒-微管连接的重要调节者)富集程度的下降。接着,梁材同学通过表达Sgo1与着丝粒结构蛋白CENP-B的融合体,将多种不同类型的外源Sgo1突变体人为地定位至突变体细胞的着丝粒区,进而分析内层着丝粒结构和功能缺陷的修复情况。实验结果显示,Sgo1与蛋白磷酸酶PP2A的结合不仅对于姐妹着丝粒粘连是重要的,而且能促进CPC在着丝粒的定位。进一步的机理研究表明,Sgo1通过结合PP2A保护了着丝粒区的黏连蛋白复合体(cohesin;姐妹染色体粘连的介导者),cohesin则通过其Pds5B亚基结合蛋白激酶Haspin,进而,Haspin一方面通过拮抗Wapl(cohesin的破坏者)增强姐妹着丝粒的粘连,另一方面通过磷酸化组蛋白H3促进CPC在着丝粒区的富集。基于这一系列实验结果,并结合国外同行关于cohesin可以结合Sgo1的重要发现,论文构建了由Sgo1-cohesin-Haspin构成正反馈调控回路的工作模型,阐述了该回路调控内层着丝粒组装的分子机制,并提出了将着丝粒区cohesin的富集程度关联于癌细胞染色体不稳定性的设想。

[2018/12]

2018年12月6日,汪方炜实验室在Journal of Biological Chemistry杂志发表题为“Aurora B kinase activity-dependent and -independent functions of the chromosomal passenger complex in regulating sister chromatid cohesion”研究论文,解析染色体乘客复合体调节染色体粘连的分子机制。汪方炜教授是通讯作者,易琦和陈亲富为共同第一作者,张妙和梁材等同学也有贡献。

有丝分裂期染色体的正确分离是亲代与子代细胞间遗传物质稳定传递的基础。作为有丝分裂最重要的调节者(此处可以省略“之一”),染色体乘客复合体(chromosomal passenger complex,简称CPC)被著名细胞生物学家、英国爱丁堡大学的William Earnshaw教授称为“有丝分裂教父” [The chromosomal passenger complex (CPC): from easy rider to the godfather of mitosis. Carmena M et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2012]。染色体乘客复合体的核心组分包括INCENP、Survivin、Borealin和Aurora B四个蛋白,其中最大的骨架亚基INCENP的氨基端CEN-BOX结合Survivin和Borealin构成CEN功能模块(CEN module),负责介导CPC在着丝粒(centromere)的定位,INCENP羧基端的IN-BOX则结合蛋白激酶Aurora B组成IN/AURKB功能模块(IN/AURKB module),负责激发并维持最大化的Aurora B激酶活性。这两个功能模块间存在间接的交互对话:CEN模块通过介导CPC在着丝粒区的富集促进Aurora B的激酶活性,而IN/AURKB模块则可以通过调节相关蛋白激酶对组蛋白的磷酸化影响CEN模块在着丝粒的定位。此外,INCENP还与异染色质蛋白HP1直接结合,但其功能不明。

染色体乘客复合体的重要功能及其复杂而精细的调节机制是有丝分裂研究领域的重要课题,同行竞争异常激烈。目前已知,CPC的激酶活性对于有丝分裂期染色体的正确分离极其重要。一方面,Aurora B通过磷酸化动粒(kinetochore)区的相关蛋白(如Hec1)去除错误连接的纺锤体微管(spindle microtubule);另一方面,Aurora B激酶活性促进纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,简称SAC)相关效应蛋白在动粒区的定位,从而激活SAC并监控染色体与纺锤体的连接状态;此外,Aurora B还能通过磷酸化Sororin参与解除姐妹染色体在臂部的粘连。用RNA干扰技术敲减四个核心组分中的任何一个蛋白,都会导致CPC整体蛋白稳定性和Aurora B激酶活性的大幅下降,严重影响有丝分裂进程。若用小分子化合物“简单粗暴”地抑制Aurora B的激酶活性,则会破坏动粒和着丝粒的结构,并改变CPC在染色体上的定位。因为这些固有问题的存在,一直不清楚CPC是否有不依赖于Aurora B激酶活性的功能。

为了解答这一科学问题,汪方炜实验室的博士生易琦在做本科毕业设计实验时就着手尝试将外源INCENP基因导入不同类型的细胞中,并成功地在人宫颈癌来源的HeLa细胞中获得稳定表达外源INCENP(野生型或多种突变体)的若干细胞系,随后利用CRISPR-Cas9基因编辑技术或RNA干扰技术实现了内源INCENP的稳定敲除或瞬时敲减。以此为基础,易琦和陈亲富两位博士生合作开展了后续一系列功能和机理探究实验。Aurora B底物蛋白磷酸化的免疫荧光染色实验显示,当细胞表达不能结合HP1的INCENP突变体时,Aurora B的激酶活性和CPC在有丝分裂期染色体上的定位基本正常,而HP1则不能富集于着丝粒区,说明在有丝分裂期CPC作用于HP1的上游并将后者招募至着丝粒区。包括活细胞实时显微成像在内的进一步功能分析实验发现,破坏INCENP与HP1的结合导致姐妹着丝粒粘连强度显著下降,染色体错误分离的发生率也明显上升。通过表达与着丝粒结构蛋白CENP-B的融合蛋白,将HP1及其下游蛋白Haspin强行招募至着丝粒区,则可以修复这些缺陷。用RNA干扰技术敲减黏连蛋白复合体(cohesin)的破坏者Wapl也得到了类似的修复效果。这些结果说明INCENP通过结合HP1以不依赖于Aurora B激酶活性的方式拮抗Wapl并保护着丝粒区的cohesin。

此外,陈亲富等还发现,在稳定表达HP1与CENP-B融合蛋白的细胞系中施加Aurora B激酶活性的小分子化合物抑制剂,仍会进一步减弱着丝粒的粘连强度,并显著降低Wapl的另一个拮抗蛋白Sgo1在着丝粒区的定位。通过将介导组蛋白H2A第120位苏氨酸磷酸化(H2A-pT120)的蛋白激酶Bub1强行招募至着丝粒区,则可以在一定程度上修复这些缺陷。这些结果说明CPC也可以通过Aurora B激酶活性保护着丝粒粘连,而且此通路依赖于Bub1在动粒区的定位。基于这一系列实验结果,并结合汪方炜实验室近期发表的相关论文(Zhou L et al., Current Biology 2017; Liang C et al., EMBO Reports 2018;Yi Q et al., EMBO Reports 2018; Qi F et al., Cell Reports 2018; Liang C et al., Journal of Biological Chemistry 2018),论文提出了染色体乘客复合体保护着丝粒区姐妹染色体粘连的工作模型:一方面,通过不依赖于Aurora B激酶活性的方式,INCENP结合并招募HP1至着丝粒,促进Haspin在着丝粒区的富集并拮抗Wapl对cohesin的破坏作用;另一方面,Aurora B以目前尚未完全明确的机制促进SAC激酶Mps1在动粒区的定位,从而使得Sgo1经由pKNL1-Bub1-H2A-pT120信号轴(p代表磷酸化)富集于着丝粒区并拮抗Wapl。