2026年8月13日，我院马为锐研究员实验室在《美国国家科学院院刊》（PNAS）发表题为“Codon optimization depletes stop codons in alternative reading frames of protein-coding nucleic acid therapeutics”的研究论文，揭示了mRNA疫苗等蛋白编码核酸类药物在序列设计中一个长期被忽视的现象：广泛使用的密码子优化策略，会系统性地清除非标准阅读框中的终止密码子，使框外翻译得以持续更长距离，从而导致移码产物的积累。研究同时提供了一个简单的解决方案。

翻译并非完美无误

蛋白质的合成依赖核糖体沿mRNA逐个密码子解码遗传信息。然而这一过程并非绝对精确——核糖体偶尔会发生移码，或在非经典起始位点启动翻译，从而进入“错误”的阅读框（框外翻译），产生非预期的蛋白产物。这类事件是翻译过程的固有属性，无法完全避免。

真正决定其后果的，是这些错误翻译能走多远。研究团队利用双荧光报告系统发现，位于非标准阅读框中的终止密码子起到了“检查点”的作用：一旦框外翻译遭遇它们，便立即终止。通过将终止密码子逐步移动到序列不同位置，团队进一步证明，终止密码子的位置直接决定了非标准阅读框的“容许长度”。

天然基因编码序列存在密集的框外翻译“检查点”

对人、猴、小鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、线虫、酵母和大肠杆菌等十种模式生物的全基因组分析显示，天然基因编码序列在非标准阅读框中普遍维持着密集分布的终止密码子，平均每20个密码子左右就出现一个。这一特征在演化上高度保守，构成了一道天然的保护机制来终止框外翻译。

治疗性核酸序列在-1阅读框严重缺失框外翻译“检查点”

研究分析了涵盖mRNA疫苗、蛋白替代治疗、CAR-T构建体、环状RNA平台、CRISPR-Cas系统及深度学习生成序列在内的120条治疗性核酸序列，发现这道天然保护严重缺失：这些序列−1阅读框中潜在翻译产物的平均长度达164个氨基酸，是天然人类基因（约27个氨基酸）的六倍。缺失并不局限于某一家公司或某一类技术平台，而是跨平台、跨研发阶段普遍存在。

其中，已获批的两款新冠mRNA疫苗（Moderna公司的mRNA-1273和Pfizer-BioNTech公司的BNT162b2）提供了一个天然的对照——二者编码完全相同的刺突蛋白，但采用了不同强度的密码子优化策略，其−1阅读框中的终止密码子数量相差达十倍。优化程度更高的一款，框外可延伸的距离也更长。

密码子表中的隐藏规律

为何会如此？研究的关键发现在于，原因就写在遗传密码表本身之中。

图. 人类“最优密码子”第三位碱基不含有尿嘧啶（U）。（A）人类密码子表。（B）人类“最优”密码子第三位碱基不含有U。

三个终止密码子UAA、UAG、UGA的共同点是——都以尿嘧啶（U）开头。而在人类细胞中被判定为“最优”的密码子，密码子第三位的碱基都不是U。由于阅读框之间存在移位关系，一个密码子第三位的碱基会成为−1阅读框中某个密码子的首位碱基。因此，如果一条序列完全按照人类“最优”密码子进行优化，其−1阅读框中便不可能再形成终止密码子。这一后果并非某种算法的缺陷，而是密码子偏好性与遗传密码结构共同作用的必然结果。

问题可以被简单解决

研究团队提出并验证了一个直接的应对策略：通过同义替换重新引入终止密码子。由于同义密码子编码相同的氨基酸，这一改动完全不影响目标蛋白的序列。

质谱分析证实，经过改造的序列中，此前可检测到的移码翻译产物几乎被完全消除，而目标蛋白的表达不受影响，mRNA稳定性也未发生改变。无论以质粒DNA还是体外转录mRNA（包括经N1-甲基假尿苷修饰的形式）递送，结论一致。

研究同时指出，恢复终止密码子并不需要在所有可能位置进行，因此可以有选择地避开会引入稀有密码子或产生非经典起始位点的位置，使该策略在实际设计中具有充分的灵活性。

图. 非标准阅读框中的终止密码子限制框外翻译产物的长度。左，天然编码序列在两个非标准阅读框内均分布有终止密码子，框外翻译在开始后不久即被终止；中，经密码子优化的治疗性序列中终止密码子被耗竭（−1阅读框尤为严重），框外翻译得以持续延伸并积累长产物；右，通过同义密码子替换恢复终止密码子，可缩短框外产物而不改变所编码的蛋白。

特别说明

马为锐研究员强调，本研究并未提供任何证据表明现有治疗性核酸产生的框外翻译产物具有临床危害，研究也不作此主张。目前尚无证据显示框外翻译产物造成健康影响。本研究所报告的，是一个客观存在的序列设计现象，以及一个可供选择的技术方案。随着核酸类药物的快速扩展，让研发者知道这一参数的存在、并具备控制它的能力，本身就是有价值的。

研究团队建议，非标准阅读框中的终止密码子分布应被纳入核酸类药物序列设计的常规考量，与表达水平、mRNA稳定性等参数并列；密码子优化算法也可在此基础上加以完善。团队在论文中提供了双荧光报告系统、终止密码子步移方法和三框翻译分析工具，相关数据与代码均已公开。

我院马为锐研究员为论文通讯作者，博士研究生刘哲伶、应镇光为共同第一作者，博士生研究生沈洛安参与了该项研究。该研究得到国家重点研发计划和国家自然科学基金资助。

原文链接

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2606609123