2018年10月18日，浙江大学生命科学研究院范衡宇教授实验室在Nucleic Acids Research杂志在线发表文章，报道了母源性mRNA的3’-端非编码区（3’-UTR）在卵母细胞不同发育时期对mRNA poly（A）尾长度和蛋白翻译活性的调控规律。
脊椎动物中，充分生长的GV期卵母细胞中积累了大量处于翻译抑制状态的母源性mRNA，它们在减数分裂成熟过程中的翻译激活对于母体-胚胎转换过程（maternal-zygotic transition，MZT）起着关键性的作用，主要参与调控纺锤体组装、第二次减数分裂中期阻滞维持以及部分母源性mRNA降解等过程。胞质中mRNA的多聚腺苷酸化与它的稳定性以及翻译激活密切相关，受到自身3’-UTR中CPE (cytoplasmic polyadenylation element)、PAS（Poly(A) signal）等蛋白识别元件的调控。不同物种的卵母细胞中，选择性激活mRNA翻译的机制是复杂多变的，但在哺乳动物中还缺乏针对性的研究。范衡宇实验室的前期研究表明，在小鼠卵子成熟过程中，MAPK级联通路的重要蛋白激酶ERK1/2通过调控CPE结合蛋白CPEB1的磷酸化和部分降解，将母源性mRNA的翻译与卵母细胞减数分裂细胞周期进程偶联起来（Development 2017）。
在本研究中，范衡宇研究团队利用三种在卵母细胞中丰富表达、在MZT过程中发挥关键生理功能、在3’-UTR中同时具有多个PAS和CPE元件，但却具有不同翻译模式的mRNA，系统研究了这一科学问题：Cpeb1在GV期就具有活跃的蛋白翻译；Btg4在GV期不翻译，而在GVBD以后发生活跃翻译；Cnot6l介于二者之间，在GV期有较弱翻译活性，在GVBD之后翻译能力大大增强。课题组克隆了这三种mRNA的3’-UTR，与GFP编码RNA拼接成融合mRNA，从而构建了3’-UTR 翻译活性的reporter，研究了CPE元件和PAS元件的不同数目和位置组合，对mRNA加尾和翻译的调控规律（图1）。
图1：以小鼠Btg4 基因为例，阐明3’-UTR对mRNA翻译激活的调控作用。A: 小鼠Btg4 基因3’-UTR中的调控元件示意图。B：把体外转录的Btg4 3’-UTR reporter mRNA注射到小鼠卵母细胞中，观察到细胞周期依赖的蛋白翻译模式。突变3’-UTR中的CPE元件，改变了reporter mRNA的翻译模式。（Dai et al, Nucleic Acids Research 2018）
在研究中课题组发现，RNA剪切与加尾复合体CPSF（Cleavage and polyadenylation-specific factor）与3’-UTR中PAS元件的结合，是启动mRNA加尾和翻译的关键步骤。于是，课题组从这一线索入手，研究了CPSF通过其关键亚基CPSF4识别3’-UTR中近端或远端的PAS序列，调控蛋白翻译和卵子成熟的生化机制。如果过表达dominant negative形式的CPSF4 (CPSF4-ΔZF2)，卵母细胞就不能启动mRNA加尾和翻译，从而使细胞中蛋白合成水平下降，不能维持正常的纺锤体组装和细胞周期进程，更不能排出第一极体（图2）。
图2：mRNA剪切与加尾复合体CPSF在小鼠卵母细胞中的功能研究。A：Poly(A) tail assay显示多种mRNA在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中poly(A)尾延长，但是过表达dominant negative形式的CPSF4 (CPSF4-ΔZF2)抑制了该过程。B：在卵母细胞中过表达CPSF4-ΔZF2，造成卵母细胞恢复减数分裂后不能形成正常纺锤体、不能排出极体。（Dai et al, Nucleic Acids Research2018）
该研究的创新性在于：1）该研究首次解析了哺乳动物卵母细胞中调控发育阶段特异性mRNA翻译的模式，特别是3′-UTR中多种关键元件的组合规律（图3）；2）首次报道3′-UTR中近端加尾信号（poly(A) signal）越过多个下游元件、介导mRNA远端加尾的现象，对经典mRNA加尾规律做了重要补充；3）首次在哺乳动物中研究了mRNA剪切与加尾复合体CPSF在卵母细胞减数分裂过程中的生理、生化功能。
这些研究发现，不但进一步揭示了遗传信息传递链上mRNA翻译调控的广谱规律，而且为辅助生殖临床实践所涉及到的卵子成熟障碍、卵子核质同步成熟、卵子老化等问题提供了新的潜在病理机制和干预靶点。由于成熟的卵母细胞体积大、细胞周期同步程度高、没有新的转录活动、减数分裂和受精过程完全由胞质中mRNA的翻译和降解来调控，因此是研究mRNA翻译调控的理想模型。本研究开发了适用于哺乳动物卵母细胞的多项RNA研究技术，如nested poly(A) tail assay、微量RNA-蛋白免疫共沉淀、3’-UTR活性的荧光报告系统等，为后续研究奠定了理论和技术基础。
图3：哺乳动物卵母细胞成熟过程中mRNA翻译的规律总结。1）未恢复减数分裂的卵母细胞中，如果具有远离CPE元件的PAS元件，就可以翻译，否则不能；2）多个CPE元件以累加效应抑制周围的PAS与CPSF4结合、阻止mRNA翻译；3）恢复减数分裂之后，由于MAPK级联通路导致CPEB1磷酸化和部分降解，解除了CPEB1对mRNA翻译的抑制作用，使得同时含有CPE和PAS元件的mRNA发生翻译激活。
原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gky971
